Tan 195 Tan 105

admin 2

0 Comment

Link

Tan 195 Tan 105 – Deteksi dan pengukuran sinyal GPCR – perbandingan sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia dan garis sel yang diabadikan

Reseptor berpasangan protein G (GPCR) adalah keluarga besar protein transmembran yang memainkan peran penting dalam banyak proses fisiologis, oleh karena itu pengembangan obat yang menargetkan GPCR sangat dianjurkan. Meskipun hasil penelitian yang dihasilkan dalam garis sel yang diabadikan telah memajukan bidang GPCR, latar belakang genetik yang homogen dan ekspresi GPCR yang berlebihan dalam garis sel ini membuat sulit untuk membandingkan hasil dengan pasien klinis. Sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia (hiPSCs) mempunyai potensi untuk mengatasi keterbatasan ini karena mengandung informasi genetik spesifik pasien dan dapat berdiferensiasi menjadi beberapa jenis sel. Deteksi GPCR di hiPSC memerlukan pelabelan yang sangat selektif dan teknik pencitraan yang sensitif. Tinjauan ini merangkum teknik penambahan protein dan transfer energi resonansi yang tersedia saat ini, serta metode pelabelan baru dan yang sudah ada. Kesulitan dalam memperluas metode deteksi yang ada ke hiPSC serta potensi hiPSC untuk memperluas penelitian GPCR ke dalam pengobatan yang dipersonalisasi juga dibahas.

Tan 195 Tan 105

Reseptor berpasangan protein G (GPCR) mewakili keluarga terbesar protein transmembran (1) yang mengubah sinyal ekstraseluler menjadi reaksi biokimia intraseluler untuk mengatur proses fisiologis dasar (2). Pengembangan obat yang menargetkan GPCR didorong secara global, dan obat yang menargetkan GPCR mencakup lebih dari 30% obat yang disetujui oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan AS (FDA) (3). Kemajuan dalam penelitian GPCR telah menghasilkan wawasan baru mengenai oligomerisasi GPCR (4), pensinyalan menyimpang (5), dan regulasi alosterik (6), dan menarik bahwa kemajuan ini terutama didasarkan pada garis sel yang diabadikan seperti ginjal embrionik manusia-293 ( HEK293) (7) atau sel ovarium hamster Cina (CHO) (8). Latar belakang genetik yang homogen dari garis sel ini, dikombinasikan dengan ekspresi berlebih yang tidak terkendali dari protein target (9), menghambat transfer pengetahuan yang diperoleh ke sel manusia melalui transmisi informasi genetik spesifik setiap individu. Selain itu, garis sel yang diabadikan mewakili jenis sel tertentu, yang membatasi kemampuan transfer hasil penelitian ke jenis sel yang berbeda. Munculnya teknologi sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia (hiPSC) dapat mengatasi keterbatasan tersebut. HiPSC dapat dihasilkan dari berbagai sel somatik (yaitu fibroblas, sel mononuklear darah tepi) dengan mengubah empat faktor transkripsi (10). Yang penting, informasi genetik spesifik pasien disimpan dalam hiPSC (11), menjadikannya sangat berharga dalam penemuan obat yang dipersonalisasi (11) sekaligus menghindari masalah etika yang muncul selama penelitian sel induk embrionik.

BACA JUGA  Mendaftar Topik Topik Yang Dapat Dikembangkan Menjadi Teks Eksplanasi

Toll Like Receptor 4 And Macrophage Scavenger Receptor 1 Crosstalk Regulates Phagocytosis Of A Fungal Pathogen

Untuk lebih memahami respons jalur pensinyalan klasik in vivo, perlu dipertahankan ekspresi masing-masing efektor dalam jalur pensinyalan GPCR (11). Oleh karena itu, studi GPCR di hiPSC memerlukan metode pelabelan dan deteksi tingkat lanjut untuk mengatasi rendahnya tingkat ekspresi GPCR agar memungkinkan studi reseptor ini pada tingkat ekspresi aslinya. Hal ini memerlukan efisiensi pelabelan dan pencitraan yang tinggi untuk mengatasi tingkat GPCR yang relatif rendah (12). Selain itu, pensinyalan GPCR adalah proses yang dinamis. Selama beberapa dekade terakhir, analisis struktur kristal telah banyak digunakan untuk mempelajari farmakologi GPCR (6,13,14); namun, sifat statisnya membatasi kemampuannya untuk menyelidiki proses intraseluler yang dinamis. Oleh karena itu, teknik pelacakan molekul tunggal dan deteksi interaksi protein-protein dapat membantu mempelajari aspek dinamis pensinyalan GPCR (15). Dalam ulasan ini, kita akan membahas metode untuk menganalisis interaksi protein, seperti transfer energi resonansi (RET) dan analisis komplemen protein (PCA), serta metode untuk mendeteksi komponen intraseluler, termasuk cAMP dan protein G teraktivasi, serta perubahan konformasi. di GPCR. dan efektor hilirnya serta interaksi bimolekuler atau multimolekuler GPCR dengan komponen seluler lainnya. Kami juga akan membahas pelabelan optik dan metode akuisisi. Secara khusus, tinjauan ini akan fokus pada teknologi dan metode untuk mendeteksi efek sinyal GPCR spesifik pasien menggunakan hiPSC sebagai platform seluler. Meskipun masih merupakan sebuah tantangan, hiPSC diharapkan menjadi bagian integral dari penelitian GPCR dan, berkat kemajuan besar dalam teknologi pelabelan dan deteksi, dapat membuka jalan bagi pengembangan lebih lanjut.

Keberhasilan pencitraan GPCR pada sel hidup mana pun bergantung pada kualitas detektor fluoresensi dan fluoresensi yang kompleks (16). Memahami kemampuan dan keterbatasan alat-alat ini merupakan langkah awal yang penting agar berhasil mempelajari GPCR dalam sel hidup. Kami terlebih dahulu menjelaskan persyaratan sensor dan mikroskop yang umum digunakan dan cocok untuk studi pensinyalan GPCR dan protein G.

Pencitraan fluoresensi dan pengukuran pendaran adalah dua teknik yang banyak digunakan untuk memvisualisasikan dan mengukur proses biologis. Pencitraan fluoresensi biasanya digunakan untuk memvisualisasikan struktur dan proses seluler dalam sel dan jaringan hidup, sedangkan pengukuran pendaran digunakan untuk menganalisis molekul dan reaksi biologis secara kuantitatif. Pencitraan fluoresensi memberikan informasi yang diselesaikan secara spasial dan melacak perubahan intensitas fluoresensi dari waktu ke waktu untuk lebih memahami proses seluler yang dinamis, sedangkan pengukuran pendaran tidak memerlukan cahaya, lebih merangsang dan sensitif, tetapi biasanya tidak memungkinkan visualisasi struktur atau proses seluler.

BACA JUGA  Reaksi Elektrolisis Na2so4

Pencitraan fluoresensi memerlukan penggunaan sensor yang sangat sensitif untuk mendeteksi sinyal lemah tanpa risiko pemutihan fluoresensi karena intensitas cahaya eksitasi yang berlebihan (17). Sebaliknya, pengukuran pendaran dilakukan secara kimia (yaitu kemiluminesensi) atau secara enzimatis (yaitu bioluminesensi) dan sangat bergantung pada sensitivitas sensor dibandingkan intensitas cahaya yang distimulasi. Di bidang GPCR, dua jenis sensor yang paling menonjol bergantung pada penerapannya: (1) sensor pencitraan lapangan dan (2) sensor semikonduktor oksida logam komplementer. Sensor gambar lapangan mencakup perangkat berpasangan muatan (CCD) dan CCD pengganda elektron (EMCCD). EMCCD memiliki efisiensi kuantum yang tinggi sekitar 90% dan memberikan amplifikasi pada chip, memungkinkan mereka mendeteksi foton tunggal (18, 19) seperti yang terlihat dalam berbagai studi pencitraan GPCR (20). Sensor semikonduktor oksida logam komplementer (CMOS) menawarkan kecepatan bingkai yang lebih tinggi dan area gambar yang lebih besar dibandingkan CCD, namun efisiensi kuantumnya yang relatif rendah (~60%) menghalangi penggunaannya dalam gambar GPCR. Namun, kemajuan terkini, seperti elemen penerangan belakang yang memandu foton ke permukaan penerima cahaya, telah menghasilkan CMOS dengan efisiensi kuantum serupa dengan EMCCD (21, 22) [misalnya 95% untuk CMOS penerangan belakang Prime 95B (23)] , sehingga cocok untuk pencitraan GPCR. Jenis lain dari detektor titik tunggal, tabung fotomultiplier (PMT), adalah detektor yang sangat sensitif, kebisingan rendah, dan respons cepat yang biasa digunakan dalam metode pemindaian untuk pencitraan GPCR (24).

Physical Sensors For Skin‐inspired Electronics

Selain jenis sensor perangkat, setiap mode pencitraan memerlukan konfigurasi perangkat yang berbeda (misalnya, lensa objektif, filter spesifik, roda filter bermotor, dan sumber cahaya). Misalnya, mikroskop fluoresensi refleksi internal total (TIRF) menggunakan tujuan dengan bukaan numerik tinggi (>1,45) (25). Perangkat yang digunakan untuk pengujian transfer energi resonansi fluoresensi (FRET) memerlukan filter warna dua dimensi khusus untuk memisahkan cahaya yang dipancarkan. Perangkat pemandu Bioluminescent Resonance Energy Transfer (BRET) memerlukan roda filter bermotor dan sumber cahaya intensitas tinggi untuk menemukan bidang fokus. Singkatnya, untuk identifikasi FRET dan BRET yang lebih baik, pilihan sensor dan instrumen pencitraan sangat penting untuk pencitraan GPCR yang akurat dan fungsinya dalam sel hidup. FRET dan BRET adalah metode paling langsung untuk mengamati interaksi protein dan dapat digunakan untuk mengamati sel hidup, yang penting untuk mempelajari jalur transduksi sinyal yang dimediasi GPCR serta memahami struktur dan fungsi GPCR (16).

BACA JUGA  Soal Tema 8 Kelas 2 Pdf

Berbagai teknik mikroskop yang memungkinkan pencitraan fluoresensi dan metode berbasis FRET telah digunakan dalam studi GPCR (Tabel 1) (36, 37). Perangkat ini berbeda dalam sumber cahaya eksitasi spesifik, filter kepadatan netral untuk mengontrol paparan laser, filter spesifik untuk memisahkan eksitasi dan cahaya yang dipancarkan, dan deteksi sensor untuk mengubah foton menjadi gambar (51). Mikroskop bidang lebar mengurangi kontras dan menurunkan kualitas gambar karena sinyal emisi yang berasal dari atas atau bawah wilayah bidang fokus. Namun, teknik ini telah digunakan untuk mengamati ratusan molekul individu secara bersamaan (52). Sebaliknya, mikroskop confocal mengontrol posisi dan ukuran area gambar, dan tujuan aperture numerik yang tinggi menghasilkan pemfokusan terbatas difraksi, memungkinkan pencitraan dua dimensi dan bagian tiga dimensi memiliki rasio signal-to-noise yang tinggi. Dalam waktu singkat. Mikroskop confocal telah digunakan untuk menentukan kolokalisasi GPCR dan efektornya (32) dan untuk memantau proses biologis seperti biosintesis oligomer GPCR grup A dalam sel hidup (53) . Pencitraan confocal juga dapat digunakan untuk mengukur GPCR, seperti mengukur stoikiometri β berlabel cyan.

Subunit) (54). Selain mengurangi polusi cahaya bidang yang tidak fokus melalui metode confocal, analisis spektral unmixing (misalnya, unmixing Ex/Em) dapat digunakan untuk mengatasi crosstalk emisi.Iradiasi donor-akseptor untuk lebih meningkatkan sinyal FRET atau BRET (55) .

Dalam mikroskop TIRF, gelombang cahaya cepat berlalu dr ingatan digunakan untuk menerangi sampel di dekat lapisan, memungkinkan studi tentang molekul yang terletak di dekat permukaan sampel. Mikroskop TIRF adalah teknik yang banyak digunakan untuk mengamati sinyal fluoresensi molekul tunggal dengan menyinari permukaan sampel yang sangat tipis (biasanya dalam kisaran 50-200 nm) (56) sehingga mengurangi kebisingan.latar belakang (57, 58). Mikroskop TIRF digunakan untuk mengamati dinamika komponen membran sel, termasuk molekul tunggal, interaksi protein-lipid, transpor membran, dan distribusi spasial GPCR. Selain itu, TIRF telah digunakan untuk memvisualisasikan oligomerisasi GPCR (26, 59) dan memantau interaksi GPCR dengan protein G atau β-arrestin (60).

Metabolic Alterations Upon Sars Cov 2 Infection And Potential Therapeutic Targets Against Coronavirus Infection

Baru-baru ini, pencitraan TIRF dua warna telah digunakan untuk memantau difusi, interaksi,

105, 195, tan 105, 195 6515, sj 195, tan 195, tan, 195 sqmt, nokian 195, dj 195, tensi 195, psr 195

Tags:

Share:

Related Post

Leave a Comment